Introducción y objetivos

Objetivos del cepario

Las Colecciones de Cultivos Microbianos son entidades en donde se realizan actividades cuyo objetivo es obtener, preservar, clasificar, estudiar y documentar de manera completa y accesible, cultivos de microorganismos axénicos, de interés específico. La información generada a partir de las colecciones tiene relevancia en diferentes ámbitos como la salud, medicina, industria farmaceútica, agricultura, biotecnología. El cepario de cultivos microbianos del CEPAVE contribuye al conocimiento de la biodiversidad de los hongos patógenos de insectos, proporcionando recursos genéticos y favoreciendo la conservación del germoplasma para futuros estudios de investigación básicos y aplicados.

Este cepario de hongos patógenos y simbiontes de insectos y de otros artrópodos del CEPAVE ha sido originada en 1988, inicialmente como resultado de los relevamientos y aislamientos realizados durante el período  1984-1988 que formaron parte del trabajo de tesis doctoral: “Incidencia de hongos patógenos de insectos de la Argentina” (FCNyM-UNLP). Posteriormente se incluyeron aislamientos de cultivos fúngicos provenientes de  relevamientos realizados en el marco de investigaciones y a partir de depósitos externos. Los cultivos puros axénicos fueron obtenidos a partir de insectos (principalmente: Hemiptera, Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Blattodea, Orthoptera y también a partir de ácaros y de arañas) recolectados en distintas localidades y regiones fitogeográficas de la República Argentina. Existen actualmente más de 780 aislamientos pertenecientes a 23 géneros fúngicos diferentes. La mayor parte del cepario está compuesta por especies pertenecientes al Phylum Ascomycota, Phylum Entomophthoromycota y Reino Straminipila (Gutiérrez et al., 2017) 10.1016/j.ram.2016.09.007, se adjunta la publicación.

Las colecciones de cultivos de microorganismos tienen gran importancia para la conservación del germoplasma y la diversidad, siendo fuentes de referencia, certificación, investigaciones, docencia, asesoramiento, transferencias a empresas y tecnológicas En la Argentina existen 18 colecciones registradas en la FELACC, (cita boletín FELACC 2015) que incluyen las de bacterias, levaduras y hongos, algunas de universidades u otras instituciones. La presente es un cepario específico de hongos entomopatógenos y simbiontes de insectos y de otros artrópodos. Los usos posibles de cultivos de hongos son para posibles desarrollos de insecticidas microbianos, y /o metabolitos antimicrobianos para futuro desarrollo en la industria farmacéutica, agricultura y otras.

Las líneas de investigación del CEPAVE están relacionadas con la interacción hongos-insectos, hongos–artrópodos, estudios de la actividad biológica, estudios de metabolitos producidos por los hongos entomopatógenos, caracterización molecular de las especies fúngicas y de sus cepas, producción masiva, escalado y formulaciones y estudios epizootiológicos, trabajando en áreas protegidas y en sistemas agrícolas a partir de insectos vectores.

Los objetivos de este cepario han sido preservar y conservar la diversidad ex situ mediante técnicas específicas de aislamientos in vitro de especies de hongos entomopatógenos y simbiontes de artrópodos (principalmente insectos).

Aislamiento e identificación taxonómica

La identificación taxonómica se realizó de acuerdo a caracteres morfológicos en cultivo y/o en el hospedador mediante las claves correspondientes (Humber, 2012, Tzean et al., 1997.) y en cuanto a la taxonomía molecular se caracterizaron las regiones ITS 1, 2, 4 , 5 epf, B tubulina, de acuerdo a las especies consideradas en los casos de identificación confirmada por taxonomía molecular.

La acronimia de este cepario es CEP y está registrada en la FELACC Federación Latinoamericana de colecciones de cultivos, con el número S1-03 y en la  WFCC (World Federation for culture collections) con el número 973. Para el establecimiento de este cepario se ha procedido de acuerdo a los requerimientos especificados por la WFCC (WFCC1999).

Bibliografía citada

Humber, R.A. 2012 Fungi Identification, IN L.A. Lacey (Ed.) Manual of Techniques in Insect Pathology. Chapter III Ac. Press, second edition, pp, 75-96. 

Tzean,S.S.; Hsieh, L.S. and Wu, W.J. 1997. Atlas of Entomopathogenic fungi from Taiwan Council of Agriculture, Executive Yuan, Taiwan.

Gutierrez A. C., Tornesello-Galván J., Manfrino R. G., Hipperdinger M., Falvo M., D´Alessandro C., López Lastra C.C. Organización y conservación de la colección de hongos patógenos y simbiontes de insectos y otros artrópodos del CEPAVE. Revista Argentina de Microbiología, 49 (2), 183-188.

MÉTODOS DE PRESERVACIÓN

Transferencias sucesivas, repiques o subcultivos

Transferencia periódica del cultivo en un medio de cultivo mínimo adecuado para cada especie fúngica, disminuyen la actividad metabólica y alargan los períodos de transferencia. Los cultivos se almacenan preferentemente en heladera a 4 °C, en tubos de ensayo bien cerrados y protegidos de la luz por periodos que oscilan entre 15 días y 2 meses, dependiendo de la especie fúngica.

Este método no se utiliza más en este cepario de cultivos.

Agua destilada estéril

Es el método más simple y que menos demanda tecnológica implica entre los otros tratados, si bien este método puede usarse para gran diversidad de especies fúngicas es mejor utilizarlo en los casos en que estos no puedan ser preservados por métodos de congelación o liofilización.

Papel

El método de preservación de cultivos en papel fue modificado y adaptado en el laboratorio de hongos entomopatógenos del CEPAVE. Se colocan tiras de papel de filtro Whatman N° 4 de 2 mm x 50 mm (previamente esterilizadas en autoclave por 20 minutos a 120 º C y secadas en estufa), sobre los cultivos esporulados durante 60 minutos. Posteriormente se dejan secar bajo cámara de flujo laminar, una vez secos se guardan en sobres de papel (15 cm x 15 cm) esterilizado o dentro de tubos de microcentrífuga tipo Eppendorf (1,5 ml) esterilizados previamente.

Aceite mineral

La preservación bajo capa de aceite mineral consiste en cubrir completamente el cultivo después de su desarrollo en medio de cultivo sólido, con una capa de aceite mineral o vaselina líquida esterilizada dos veces en autoclave. Los cultivos se pueden conservar a temperatura ambiente o en heladera por períodos de varios años.

Sílica gel

La preservación de esporas en cristales de sílica gel anhidra sin indicador de color, se debe realizar en freezer -20 º C aunque también es posible almacenar los hongos inoculados en sílica gel a temperatura ambiente.

Criopreservación

Preservación por congelamiento

Las células a congelar pueden ser re-suspendidas directamente en un agente crioprotector o se puede agregar el mismo como aditivo al medio de cultivo. Se pueden usar muchos crioprotectores para prevenir la formación de cristales de hielo durante el congelamiento, almacenamiento y descongelamiento de los cultivos.

Preservación por congelamiento en freezer -20 y -70 ºC

Para el método de congelación de los cultivos en freezer a -20 y -70 ºC se deben realizar cortes de cubos de 1 cm3 de un cultivo esporulado que luego se colocan dentro de frascos estériles de 1,5 ml conteniendo glicerol estéril al 10% (utilizado como crioprotector).  

Preservación por congelamiento en ultra frío a -196 ºC

Este método es el más complejo en criopreservación e involucra el congelamiento en viales, en un freezer controlado mediante series programables y computarizado, seguido por un almacenaje a -196 ºC, inmerso en nitrógeno líquido, En el caso del nitrógeno líquido, la conservación podría prolongarse por muchos años.

Liofilización

La conservación por liofilización es un método estándar usado para muchos hongos, que consiste en extraer toda el agua de un cultivo y preservar el material fúngico en ampollas cerradas al vacío, a temperatura de 4 ºC. La liofilización está considerada como el método más adecuado para la preservación de la mayoría de los microorganismos incluyendo muchas especies de hongos entomopatógenos.

Bibliografía

López Lastra, C.C. y Gutierrez, A.C. 2019.Métodos de preservación de cultivos de hongos entomopatógenos En. Micopatología de artrópodos, López Lastra y Lecuona Eds. Cap. 9. 167-178. Inta Ediciones ISBN 978-987-521-975-5.

Davel, G. 2019. Colecciones de cultivos microbianos En. Micopatología de artrópodos, Eds. López Lastra y Lecuona. Cap. 10. Pp: 179-192. Inta Ediciones, ISBN 978-987-521-975-5.Buenos Aires, Argentina.